成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶的制作方法

文档序号:19943682发布日期:2020-02-14 23:37
成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶的制作方法
本发明涉及生物领域,具体地,本发明涉及成构建体、重组菌株及其制备方法、利用大肠杆菌制备fgf21蛋白的方法、制备fgf21蛋白晶体的方法、fgf21蛋白晶体、药物组合物及其药物联合。
背景技术
:fgf21是成纤维细胞生长因子家族成员之一,该家族成员的主要生理功能为细胞增殖、分化和代谢的调节。该家族有22个成员,它们的一级氨基酸序列具有一定的同源性,在生物学功能方面也有类似性,在促进胚胎发育、组织形成或修复、变异细胞生长、炎症或是血栓形成等过程中发挥着重要的作用。例如,其家族蛋白对于成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞都有着促增殖和分裂的作用。fgf家族蛋白发挥生物学效应需要通过和靶细胞的膜表面受体结合,该结合主要分为两种不同的形式,其中,通过硫酸肝素锚定与成纤维细胞生长因子受体(fgfr)结合从而调节细胞的分化与增殖是该家族成员最主要的经典作用途径。fgf家族蛋白可以划分为7个亚家族,其中成纤维细胞生长因子21(fgf21)与fgf19和fgf23同属一个亚家族,该亚家族成员发挥信号传导作用的方式与其他亚家族的经典途径不同,该三者都是通过辅助受体βklotho的协助来激活细胞膜表面的fgfr,从而发挥作用来调节靶细胞的代谢。人fgf21氨基酸组成共有209个,n-端有由28个氨基酸组成的信号肽,相对分子质量为22.3kda。与其他fgf家族成员一致,fgf21也有其特定的表达部位,其在肝脏、脂肪组织以及胰腺中均有表达,其中肝脏是其最主要的表达场所。至今为止,共发现的fgf受体有5种,均为酪氨酸激酶受体,其中fgf21能够刺激fgfr1,fgfr2以及fgfr4中的酪氨酸磷酸化。目前,国内外关于fgf21的制备主要仍是利用原核体系中包涵体复性的方法进行,即是利用原核表达得到蛋白,但大部分表达产物均存在于包涵体中,需要通过蛋白质变性复性等多个过程才能够得到目的蛋白。这种方式纯化的fgf21蛋白产率低,蛋白活性弱,并且存在异构体杂质。近来,也有研究者将蛋白进行修饰或利用真核表达系统来进行fgf21蛋白的制备,如王会岩等人将重组fgf21直接与小泛素相关修饰蛋白融合后,在大肠杆菌中进行表达来实现蛋白的可溶性表达,但该方法表达水平和活性相对较低;付宏岐等利用植物病毒载体,在烟草植物中表达分离纯化出fgf21蛋白,但非融合的fgf21基因未能在烟草植物种瞬时高水平表达,并且真核表达系统的成本较于原核表达系统更高。除此之外,也有研究者利用融合表达技术,将fgf21与分子伴侣进行共表达,但该方法所制备得到的fgf21在n-端具有不均一性,会影响其发挥生物活性。因而,fgf21的制备、提纯、结晶仍有待开发和改进。技术实现要素:现有技术中关于fgf21的制备主要仍是利用原核体系中包涵体复性的方法进行,即利用原核表达得到蛋白,但大部分表达产物均存在于包涵体中,需要通过蛋白质变性复性等多个过程才能够得到目的蛋白。这种方式纯化的fgf21蛋白产率低,蛋白活性弱,并且存在异构体杂质。另外,现有技术中还没有关于fgf21结晶技术和晶体的研究,发明人发现,现有技术的fgf19和fgf23结晶的条件并不适宜获得fgf21晶体。基于上述事实和问题的认识和发现,发明人提出了一种新的利用原核体系表达fgf21基因的方法,该方法通过引入纯化标签,构建出了原核系统(如大肠杆菌)可溶性高水平表达fgf21的方法,克服了包涵体复性制备蛋白的缺点,同时利用多种纯化方式得到了纯度在95%以上的fgf21蛋白,并通过实验证实了,通过该方法表达获得的fgf21具有缓解胰岛素抵抗的活性,并且发明人还首次提出了fgf21的结晶条件,首次得到了fgf21蛋白结晶,为解析fgf21空间构型以及阐明fgf21发挥生物活性的机制奠定基础,同时也为fgf21作为药用物质奠定基础。在本发明的第一方面,本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例,所述构建体包括:fgf21基因29-209片段以及携带有纯化标签的表达载体,所述纯化标签的5’端与所述fgf21基因29-209片段的3’端相连。本领域技术人员所公知的是,目标蛋白与纯化标签蛋白构成的融合蛋白的表达量会相对于目标蛋白的表达量有所提升,但发明人在实验中却意外地发现,对于制备可溶性的目的蛋白fgf21,选择29-138,29-149以及29-209三个蛋白片段,分别与纯化标签(his标签或gst标签)融合后,发现只有29-209蛋白片段与纯化标签融合后获得的融合蛋白的表达量提高了,而29-138,29-149蛋白片段与纯化标签的融合蛋白的表达量依然很低。因而,根据本发明实施例的构建体是发明人在实验中意外发现地能够显著高表达fgf21的构建体,将根据本发明实施例的构建体导入宿主细胞后fgf21的表达量高、纯化简单,能将fgf21蛋白纯化到95%以上,且表达出的fgf21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。根据本发明的实施例,上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:根据本发明的实施例,所述表达载体为原核细胞表达载体。根据本发明的实施例,所述原核表达载体为pet-28a-tev以及pgex-4t-2。其中,pet-28a-tev是由pet-28a改造获得,携带his标签,pgex-4t-2携带gst标签。由此,可在融合蛋白中引入纯化标签。根据本发明的实施例,所述fgf21基因29-209片段具有seqidno:1所示的核苷酸序列。cacccgattccggattcctctcagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgggacggtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgcttcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccagggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactaccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgatgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgcttcctga(seqidno:1)。根据本发明的实施例,所述纯化标签包括选自his和gst的至少之一。发明人发现,his和gst的至少之一的标签的引入,能够通过增加融合蛋白的水溶性而避免原核表达系统中包涵体的出现,进而提高fgf21的产量。根据本发明实施例的构建体导入宿主细胞内,带有his标签的表达的fgf21蛋白产量为每升菌液1.49mg,带有gst标签的表达的蛋白产量为每升菌液1.026mg。根据本发明的实施例,所述构建体具有seqidno:2所示的核苷酸序列。atgggcagcagccatcatcatcatcacagcagcggcgaaacctgtattttcagggcatatcacccgattccggattcctctcagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgggacggtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgcttcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccagggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactaccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgatgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgcttcctgactcgagcaccaccaccaccaccac(seqidno:2)。在本发明的第二方面,本发明提出了一种重组菌株。根据本发明的实施例,所述重组菌株含有前面所述的构建体。发明人通过实验发现,含有前面所述构建体的重组菌株的fgf21的表达量高,fgf21蛋白纯化简单,能将fgf21蛋白纯化到95%以上,且该重组菌株最终表达出的fgf21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。根据本发明的实施例,上述重组菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:根据本发明的实施例,所述重组菌株为大肠杆菌。大肠杆菌易于培养,生产成本低。在本发明的第三方面,本发明提出了一种制备前面所述的重组菌株的方法。根据本发明的实施例,将前面所述的构建体导入宿主细胞中。如前所述,根据本发明实施例的重组菌株fgf21的表达量高、纯化简单,能将fgf21蛋白纯化到95%以上,且表达出的fgf21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:根据本发明的实施例,所述宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌易于培养,生产成本低。在本发明的第四方面,本发明提出了一种利用大肠杆菌制备fgf21蛋白的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:在适于fgf21蛋白表达的条件下,培养前面所述的重组菌株或依据前面所述的方法获得的重组菌株,以便获得所述fgf21蛋白。如前所述,根据本发明实施例的方法获得的fgf21的表达量高、纯化简单,能将fgf21蛋白纯化到95%以上,且根据本发明实施例的方法表达出的fgf21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:根据本发明的实施例,所述方法进一步包括对所述fgf21蛋白进行第一纯化处理。根据本发明的实施例,所述第一纯化处理是通过亲和层析、切除标签、离子交换层析以及凝胶过滤层析的至少之一进行的。根据本发明的实施例,所述方法进一步包括对纯化处理产物进行酶切处理,以便去除纯化标签。根据本发明的实施例,所述酶切处理是在tev酶消化下进行的。根据本发明的实施例,进一步包括对酶切处理产物进行第二纯化处理。根据本发明的实施例,所述第二纯化处理是通过亲和层析、切除标签、离子交换层析以及凝胶过滤层析的至少之一进行的。根据本发明的实施例,上述纯化处理,如无特殊说明,均可以按照本领域技术常规的技术手段进行。在本发明的第五方面,本发明提出了一种制备fgf21蛋白晶体的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:(1)依据前面所述的方法制备fgf21蛋白;(2)将步骤(1)获得的蛋白进行结晶处理,以便获得所述fgf21蛋白晶体,所述结晶处理是在60%tacsimate、0.1m缓冲液、ph为7.0、温度为4摄氏度的条件下进行的。本领域技术人员所公知,蛋白质结晶过程中加入沉淀剂以降低水的流动性,增加蛋白的有效浓度是蛋白质结晶过程中的重要过程,沉淀剂的选择和优化对于晶体形成至关重要,常见的沉淀剂包括盐以及聚合物。在现有技术的结晶条件中,以聚乙二醇为沉淀剂的条件占据60%,fgf19是在沉淀剂为聚乙二醇的条件下形成晶体,fgf23是在硫酸铵的条件下结晶,发明人通过实验发现,在对fgf21结晶条件进行初步筛选时,上述常见的沉淀剂均未能使fgf21形成晶体,只有沉淀剂tacsimate(是丙二酸钠、醋酸钠、柠檬酸三钠、琥珀酸、dl-苹果酸、甲酸钠以及酒石酸二钠的混合物)才能使得fgf21形成晶体。进而,在上述条件下,能得到针状的fdf21蛋白结晶,且所得到的fgf21蛋白晶体具有缓解胰岛素抵抗功能。根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征之一:根据本发明的实施例,所述缓冲液为bis-trispropane、tris或mops。发明人通过实验发现,在上述结晶条件中加入去污剂、小分子或是金属离子对蛋白质结晶情况没有改善,并且伴有蛋白质沉淀产生;改变沉淀剂浓度和ph值也对蛋白质晶体条件的优化没有显著效果;而改变缓冲液的种类,可以改善fgf蛋白的结晶状况。根据本发明的实施例的方法,在缓冲液为bis-trispropane、tris或mops的条件下能得到结晶状态较好的fgf21蛋白。根据本发明的实施例,所述缓冲液为tris或mops。发明人通过实验发现,将0.1mbis-trispropane更换为0.1m的tris或者mops,可以显著提高fgf21蛋白的结晶状况。根据本发明的实施例的方法,在缓冲液为tris或mops的条件下能得到结晶状态更好的fgf21蛋白。在本发明的第六方面,本发明提出了一种fgf21蛋白晶体。根据本发明的实施例,所述fgf21蛋白晶体是通过前面所述的方法制备获得的。根据本发明实施例的fgf21蛋白晶体是针状的,且具有缓解胰岛素抵抗功能。在本发明的第七方面,本发明提出了前面所述的fgf21蛋白晶体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例,所述药物用于治疗或预防2型糖尿病。如前所述,前面所述的fgf21蛋白晶体具有缓解胰岛素抵抗功能,进而利用前面所述的fgf21蛋白晶体制备获得的药物也具有缓解胰岛素抵抗功能,可治疗或预防2型糖尿病。在本发明的第八方面,本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例,所述药物组合物包括根据前面所述的方法制备获得的fgf蛋白和/或前面所述的fgf21蛋白晶体。如前所述,上述fgf21蛋白和fgf21蛋白晶体均具有缓解胰岛素抵抗的功能,进而包含上述fgf21蛋白和/或fgf21蛋白晶体的药物组合物也具有缓解胰岛素抵抗的功能。在本发明的第九方面,本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例,包括根据前面所述的方法制备获得的fgf21蛋白和/或前面所述的fgf21蛋白晶体和其它可用于治疗或预防2型糖尿病的药物,所述其它可用于治疗或预防抗2型糖尿病的药物包括:双胍类降糖物质、促胰岛素分泌剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂类物质、胰岛素增敏剂、胰岛素及胰岛素类似物、胰高血糖素样肽1、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂或二肽肌肽酶4抑制剂。如前所述,上述fgf21蛋白和fgf21蛋白晶体均具有缓解胰岛素抵抗的功能,进而与其它可用于治疗或预防2型糖尿病的药物联用,能更好地治疗2型糖尿病。根据本发明的一些实施例,本发明的用于治疗2型糖尿病的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体,且药物组合物的剂型不受特别限制。对于口服给药,该药物上可接受的载体可以包括粘合剂,润滑剂,崩解剂,赋形剂,增溶剂,分散剂,稳定剂,悬浮剂,着色剂和芳香剂。对于局部给药的制剂,药物上可接受的载体可以包括碱,赋形剂,润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如,对于口服给药,药物组合物可以被制备成小片,片剂,胶囊,酏剂,混悬液,糖浆或薄片。药物组合物还可以被制备成溶液,悬浮液,药片,药丸,胶囊和长效制剂。其中,根据本发明的一些具体示例,适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液的可以包括:乳糖,葡萄糖,蔗糖,山梨糖醇,甘露醇,木糖醇,赤藻糖醇,麦芽糖醇,淀粉,阿拉伯橡胶,藻酸盐,凝胶,磷酸钙,硅酸钙,纤维素,甲基纤维素,微晶纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,水,羟基苯甲酸甲酯,羟苯丙酯,滑石,硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的另一些实施例,本发明的药物组合物中还可以包括填充剂,抗凝血剂,润滑剂,保湿剂,芳香剂和防腐剂。根据本发明的实施例,本发明的药物组合物能够用于缓解胰岛素抵抗。因而,本发明的药物组合物可以治疗2型糖尿病。在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物可以通过常见的途径被给药,只要它可以到达预期的组织。此外,本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定,该因素包括要被治疗的疾病类型,给药途径,病人年龄,性别,体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例,日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂,以在整个时间段内以1次、2次或多次给药,只要达到治疗有效量即可。术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量,也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如,在2型糖尿病的减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症,但将为疾病或病症提供治疗,使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防,或者疾病或病症的症状得以缓解,或者疾病或病症的期限被改变,或者例如疾病或病症变得不严重,或者加速康复。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指2型糖尿病)的治疗,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防2型糖尿病)或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述fgf21蛋白和/或fgf蛋白晶体给予有需要的个体。根据本发明的实施例,本发明的药物或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用,或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时,它们可序贯地或同时地给予个体。或者,本发明的药物组合物可包含本发明的fgf21蛋白和/或fgf21蛋白晶体、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。附图说明图1是根据本发明实施例的fgf21基因克隆pcr电泳图;图2是根据本发明实施例的不同蛋白片段的表达量电泳图,其中,a为带有his标签蛋白经过亲和层析后利用咪唑洗脱的电泳图,b为带有gst标签蛋白经过亲和层析后利用10mmgsh洗脱的电泳图,缓冲液为20mmtris,1mnacl,ph8.0,泳道m为标准蛋白分子量marker;图3是根据本发明实施例的fgf21亲和层析洗脱后电泳图,其中,a为带有his标签蛋白电泳图,利用咪唑洗脱,b为带有gst标签蛋白电泳图,利用10mmgsh洗脱,缓冲液为20mmtris,1mnacl,ph8.0,泳道m为标准蛋白分子量marker;图4是根据本发明实施例的fgf21蛋白经tev酶切后重新反挂ni亲和柱的sds-page检测图(his标签),泳道ft为tev酶切掉his标签反挂镍柱后的穿透液,buffer为缓冲液洗脱,洗脱液为20mm,40mm以及400mm咪唑洗脱;图5是根据本发明实施例的fgf21蛋白经tev酶切后重新反挂ni亲和柱的sds-page检测图(gst标签),泳道m为标准蛋白分子量marker,b为tev酶切前,a为tev酶切后,ft为tev酶切掉gst标签反挂镍柱后的穿透液,buffer为缓冲液洗脱,洗脱液为20mm,40mm以及400mm咪唑;图6是根据本发明实施例的fgf21阴离子交换层析纯化后sds-page检测图(his标签),其中,泳道m为标准蛋白分子量marker,ft为穿透液,洗脱液为含有100mm,200mm,300mm,400mm,600mm,800mm,900mm以及1mnacl的缓冲液,缓冲液为20mmtris,0mnacl,ph8.0;图7是根据本发明实施例的fgf21阴离子交换层析纯化后的sds-page检测图(gst标签),其中,泳道m为标准蛋白分子量marker,ft为穿透液,洗脱液为含有100mm,200mm,300mm,400mm,600mm,800mm,900mm以及1mnacl的缓冲液,缓冲液为20mmtris,0mnacl,ph8.0;图8是根据本发明实施例的fgf21分子筛凝胶过滤层析纯化(his标签),其中,图中横坐标为洗脱体积,纵坐标为蛋白的紫外吸收值,内插电泳图中泳道1-11分别为第12-22ml分子筛的穿透液电泳图,泳道m为标准蛋白分子量marker;图9是根据本发明实施例的fgf21分子筛凝胶过滤层析纯化(gst标签),其中,图中横坐标为洗脱体积,纵坐标为蛋白的紫外吸收值,内插电泳图中泳道1-11分别为第13-23ml分子筛的穿透液电泳图,泳道m为标准蛋白分子量marker;图10是根据本发明实施例的高胰岛素建立hepg2细胞的胰岛素抵抗模型;图11是根据本发明实施例的不同浓度fgf21对hepg2细胞葡萄糖吸收的影响,其中,图a为不同剂量fgf21对于细胞活性的影响,图b为对于hepg2细胞葡萄糖吸收的影响;图12是根据本发明实施例的fgf21缓解胰岛素抵抗的机制研究,其中,图a为对于glut1表达的影响,图b为对于p-erk1/2表达量的影响;图13是根据本发明实施例的fgf19和fgf23对于hepg2细胞活性以及葡萄糖吸收的影响;图14是根据本发明实施例的fgf21,fgf19和fgf23一级结构比较,其中,aaq89444.1,aaq88669.1以及aag9917.1分别表示fgf21(208个氨基酸),fgf19(216个氨基酸)以及fgf23(251个氨基酸);图15是根据本发明实施例的fgf19,fgf21和fgf23二级结构比较,其中,图a,b,c分别表示fgf19,fgf21和fgf23的二级结构示意图;图16是根据本发明实施例的一些条件下出现的气泡样(a)或暗影(b);图17是根据本发明实施例的fgf21初筛12天后晶体状态图,其中,a、b、c、d分别为针状晶体、密集的细小晶体、形状不规则的晶体以及放射性晶体;以及图18是根据本发明实施例的fgf21优化后晶体,其中,图a为缓冲液更换为tris的晶体,图b为缓冲液更换为mops的晶体。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。下面简写词的使用贯穿本发明:下面将详细描述本发明的实施例。实施例1fgf21蛋白的原核制备1、实验材料与仪器(1)实验菌株选用大肠杆菌jm109作为克隆时所需菌株,大肠杆菌bl21(de3)作为蛋白表达所需菌株进行实验。(2)实验载体选用pet-28a-tev(由pet-28a改造)和pgex-4t-2载体。(3)层析介质主要包括bio-radimacni-chargedresin、geglutathionesepharose、genisepharose6fastflow、gesuperdex20010/300以及gemonoqtm5/50gl。(4)实验仪器本发明所用仪器设备如表1所示。表1:fgf21原核制备实验主要仪器设备2、实验试剂(1)酶本实施例所需taqdna聚合酶以及tev蛋白酶是由本实验室表达纯化所得,而其他所用酶试剂均购买自takara等试剂公司。(2)化学试剂本章研究所使用主要实验试剂如表2所示。表2:fgf21表达和纯化实验主要实验试剂(3)其他常用试剂的配制抗生素溶液:称取2.5g氨卞青霉素或卡那霉素固体,将其溶解于50ml超纯水中,放置于-20℃保存备用。lb培养基:称取10g胰蛋白胨,10gnacl,5g酵母提取物溶解于1l超纯水中,利用121℃灭菌20min后,放置于4℃保存备用。5×tbs缓冲液:称取54.5gtris以及27.8g硼酸溶解于1l超纯水中。50×tae电泳缓冲液:称取242gtris,37.2gna2edta-2h2o溶解于800ml超纯水中,完全溶解后再加入57.1ml冰乙酸,定容至1l。5×蛋白上样缓冲液:称取3.025gtris,0.5g溴酚蓝,10gsds,5g巯基乙醇以及50ml甘油,溶解于100ml超纯水中。3、载体构建(1)pcrpcr引物如表3所示。表3:pcr引物列表引物名称5’引物序列3’fgf2129bamhigcggatcccacccgattccggattcctctcfgf21209xholgcctcgagtcagcttgcgtagctcgggctgcgfgf2129ndeiactcatatgcacccgattccggattcctctcfgf21146xholgcctcgagtcacagatgcagcggcagaccatgfgf21138xholgcctcgagtcattcagactggtacacgttgtag以fgf21cdna作为模板,通过聚合酶链式反应(pcr)扩增,得到三个片段的fgf21目的基因(29-138,29-146以及29-209)。pcr反应体系(20μl):pcr反应程序为:(以上3个步骤进行30个循环)72℃10min4℃保温(2)dna片段的胶回收dna片段经过琼脂糖凝胶电泳后,用eb浸泡显色,再从胶块切下含有目的dna的胶条。向离心管中加入适量溶胶液后,利用55℃温浴,此期间上下颠倒混匀至胶条溶解。待溶胶液冷却至室温后,分批次将600μl溶液加入吸附柱中,每次加入后室温静置2min,再用10000g离心1min过柱。溶胶液过柱3次后,向吸附柱中加入700μl漂洗液,再利用10000g离心1min以漂洗吸附柱,重复漂洗一次。弃去漂洗液后,将离心管用10000g离心2min。随后,将吸附柱转移到已灭菌的1.5ml离心管中,在超净台下吹干。向吸附柱滤膜中央加入55℃温浴处理的洗脱液40μl,37℃恒温箱中孵育5min,最后利用10000g离心2min以回收目的dna,放置于-20℃保存。(3)双酶切反应回收后的dna片段与载体进行双酶切反应,酶切体系共20.0μl:加入后,在37℃下进行反应,酶切反应时间为dna片段4小时,载体1小时。(4)dna的连接反应双酶切后的fgf21目的基因与原核表达载体pet-28a-tev以及pgex-4t-2在16℃连接5h,连接反应体系(10μl)如下:加入溶液后吸打混匀,然后高速离心,反应过夜,用于转化。(5)大肠杆菌感受态细胞的制备将感受态菌种bl21(de3)划线接种于无抗性lb平板培养基上,放置于37℃培养12小时。随后,挑取单菌落置于含相应抗生素lb培养基中,放置于37℃摇床中以200rpm转速振荡培养过夜。过夜后,再取1ml培养物转接于100mllb培养基中,放置在37℃摇床中以200rpm转速振荡培养直至od600值达到0.5。将培养后的菌液转入50ml离心管中,放置在冰浴中冷却。在4℃条件下,利用2500g离心5min后弃上清,以收集菌体。再向每管中加入30ml已提前预冷的0.1mcacl2溶液,并按照同一方向温和转动离心管,使得细胞均匀悬浮。接着,将离心管放置在冰浴10min后再利用4℃2500g离心10min以收集菌体。弃上清,再次加入预冷0.1mcacl2溶液轻轻重悬细胞。随后,加入1.5mldmso后轻轻混匀,冰上放置10min后,将菌液迅速分装到经过冷却处理的无菌离心管中,用液氮速冻并储存于-80℃保存。(6)热激法转化大肠杆菌感受态细胞取大肠杆菌感受态细胞100μl于冰上解冻后,在超净台中加入10μl连接产物,并轻轻混匀,随后冰浴30min。在42℃条件下,用金属浴热激90秒,再立即置于冰上,冷却5min。再加入500μl无抗性lb培养基,放置于37℃培养箱中孵育40min。随后,将孵育后的菌液涂于带有相应抗性的lb平板上置于超净台晾干,于37℃倒置培养12小时后挑取单菌落进行鉴定。(7)碱裂解法小量提取质粒挑取单菌落于带有相应抗性的2mllb培养基中,在37℃下,以200rpm转速在摇床中进行培养过夜。次日,将菌液倒入2ml离心管中,10000g离心1min,弃上清以收集菌体。随后,加入150μl溶液ⅰ(25mmtris-hclph8.0加上10mmedtaph8.0),使得菌体充分悬浮;再加入新配制的200μl溶液ⅱ(0.2mnaoh加上1%sds),温和地上下混匀6次,以保证溶液充分接触到菌体。之后,加入150μl已经预冷的溶液ⅲ(3mkacph4.6),温和地上下混匀6次后,利用16000g离心10min。将上清吸取至新的1.5ml离心管中,再加入800μl无水乙醇,混匀后放置在-20℃冷冻30min。随后,利用16000g离心10min,弃上清,再加入500μl75%乙醇,利用16000g离心3min洗涤沉淀一次,弃上清(尽量吸干液体),并在超净台中吹干。最后,用50μl含rnasea(10μg/μl)的无菌水溶解质粒以备用。(8)质粒鉴定质粒鉴定采用限制性内切酶酶切法和pcr进行,并将质粒鉴定正确且dna测序无误的质粒转化表达感受态细胞。4、fgf21蛋白的原核表达(1)目的蛋白fgf21的小量表达挑取单菌落接种到含2ml带有相应抗性的lb液体培养基的指形管中,于37℃下以200rpm转速在摇床中培养。当菌液的od600值达到1.0时,则取1.0ml菌液加入1.5ml的离心管,14800rpm离心1min,弃上清,再高速瞬离,吸弃上清,再加入20μl5×loadingbuffer,沸水浴10min,10000rpm离心10min待用(诱导前的样品);同时,向指形管内余下的1ml菌液中加入iptg至其终浓度为1mm,以诱导蛋白表达,此时将指形管放置于18℃,200rpm培养3h,随后将菌液移入1.5ml的离心管,以同样的操作处理诱导后所得样品,并通过sds-page电泳观察诱导前后的样品差异,以判断表达效果。(2)目的蛋白的大量表达挑取单菌落接种到2mllb培养基中首先进行小量培养,8小时后再转接到1llb培养基中进行大量培养,培养时放置在37℃下培养12小时,当600nm下的吸光值od600达到0.7后,加入终浓度为0.2mm的iptg,在18℃条件下诱导表达蛋白12小时。5、fgf21蛋白的纯化(1)亲和层析将诱导后的菌液收集后倒入两个500ml离心瓶内,在4℃,4000g条件下离心10min以回收菌体,同时弃掉上清。再用40ml的溶液a(20mmtris-hclph8.0,1mnacl)重悬菌体。对于带有his标签的蛋白菌液,向其中加入终浓度1mm的蛋白酶抑制剂pmsf,0.1%triton以及20mm咪唑。对于带有gst标签的蛋白菌液,加入终浓度1mm蛋白酶抑制剂pmsf,0.1%triton即可。随后,在冰盐浴下超声(工作2sec,间歇4sec,总时间15min)破碎菌体细胞。将破碎后的菌体悬液在4℃条件下,用20000g离心30min,再将上清液利用0.22μm滤膜过滤。随后,对于含有his标签的蛋白,在4℃条件下,将蛋白上清液以0.5ml/min的流速利用恒流泵载入bio-radni亲和柱中,同时用烧杯收集穿透液,此过程重复两次。对于含有gst标签的蛋白,需将ni亲和柱换成gst柱,再用20ml溶液a冲洗ni亲和柱或gst柱。对于ni亲和柱层析后,依次用10ml含不同咪唑浓度的溶液a对ni亲和柱进行梯度洗脱,咪唑的浓度梯度为20、60、100和400mm。而在gst柱亲和层析后,用10ml含10mm还原型gsh的溶液a对gst柱进行洗脱。(2)tev酶切去除his标签和gst标签将亲和层析洗脱后所得目标蛋白用超滤管去除咪唑或gsh,主要方法为浓缩—添加溶液—浓缩—添加溶液循环的反复稀释方法。随后,将蛋白与tev酶按摩尔比10:1混匀,在4℃条件下旋转过夜酶切。次日,将酶切后的蛋白混合液用ni亲和柱纯化(his标签蛋白)或经gst柱后再用ni亲和柱纯化(gst标签蛋白),并收集穿透液,用含有20mm、40mm和400mm咪唑的溶液a逐步洗脱ni亲和柱,而对于gst柱则用10ml含10mmgsh的溶液a进行洗脱并收集洗脱液。(3)离子交换层析离子交换层析是用gemonoqtm5/50gl填料手动装填的阴离子交换柱(q柱)。首先,用高盐溶液(20mmtris-hclph8.0,1mnacl)将q柱冲洗2个柱体积,再用无盐溶液(20mmtris-hclph8.0)平衡4个柱体积。其次,将目的蛋白样品浓缩后再用无盐溶液进行稀释,使得其最终nacl浓度不大于100mm。再将目的蛋白溶液通过q柱,随后依次用10ml含有不用浓度nacl的缓冲液(nacl浓度从100mm至1000mm逐渐增加,用高盐和无盐溶液配置得到)洗脱q柱,并收集其穿透液和洗脱液。(4)凝胶过滤层析凝胶过滤层析是在4℃条件下,用ge公司的superdex20010/300在bio-radfplc仪器上进行。首先用凝胶过滤层析的缓冲溶液24ml(20mmtris-hclph8.0,150mmnacl)平衡1个柱体积,随后将蛋白样品浓缩至1ml上样,调节流速为0.3-0.4ml/min。6、蛋白浓度测定选用bradford法来测定蛋白浓度,考马斯亮蓝g250单独存在时呈棕红色,最大吸收峰在465nm,当与蛋白质结合后,可以产生蓝色的化合物,最大吸收峰变为595nm。在一定范围内,考马斯亮蓝g250-蛋白质复合物在595nm下的吸光度与蛋白浓度呈线性关系,因此可以通过检测吸光值来计算蛋白质的浓度[49]。具体操作方法如下,首先将不同浓度梯度的bsa加入石英比色皿中,再向每管中加入1mlbio-radproteinassay蛋白定量检测液。随后将溶液混合均匀,等待5min后测定其在波长为595时的吸光值od595,每个浓度样品做三次平行。随后,以bsa浓度为横坐标,波长为595时的吸光值od595为纵坐标绘制标准曲线。则,待测蛋白浓度(mg/ml)=19.542×od595/v(待测蛋白)-1.4126,其中v(待测蛋白)表示待测蛋白的体积(μl),od595是待测样品在波长595nm处的吸光值。7、质谱鉴定(1)蛋白质胶内酶解首先,用干净刀片切下目的条带,并切成1mm3的小方块。再利用125mmnh4hco3/50%乙腈溶液洗胶块三次,直至考马斯亮蓝脱去。随后,加入10mmdtt/125mmnh4hco3溶液,在56℃水浴下反应30min以进行还原。离心去除上清,再加入55mmiam/125mmnh4hco3溶液,反应30min,此时需注意避光。接着,用50%乙腈溶液洗胶块两遍,真空抽干,加入胰蛋白酶,在25mmnh4hco3,ph8.0溶液中,37℃酶解过夜。酶解结束后,加入0.5%甲酸/50%乙腈溶液抽提肽段三次,将得到的抽提液合并,真空抽干。(2)lc-ms/ms检测使用sciextripletof5600+液质联用系统对样品进行质谱检测。将酶解后的肽段溶解于2%乙腈/0.1%甲酸的上样缓冲液中,并通过自动进样器进样,肽段首先结合在c18trap柱(5μm,100μm×20mm)上,然后通过洗脱至c18分析柱(3μm,75μm×150mm)进行色谱分离,流速300nl/min,通过逐渐升高的有机相浓度将肽段洗脱下来,利用电喷雾进入质谱,梯度时长为60min,流动相为水相(2%乙腈/0.1%甲酸/98%水)和有机相(98%乙腈/0.1%甲酸/2%水)。质谱数据利用ida(信息依赖性采集)模式采集,在每个循环的扫描中,首先采集一级质谱图(离子累积时间250ms,扫描范围350-1500m/z),接着以top40的模式采集二级质谱图(离子累积时间50ms,扫描范围100-1500m/z),动态排除时间设置为15s。(3)质谱数据分析将质谱谱图文件提交到proteinpilot4.5软件中(absciex),数据库使用的是uniprot上下载的fgf21蛋白序列。对鉴定的蛋白结果,认为肽段unusedscore>1.3(可信度95%以上)时是可信肽段,保留包含至少含有1条unique肽段的蛋白质。8、fgf21缓解胰岛素抵抗的活性验证(1)胰岛素抵抗模型的建立当hepg2细胞传至第三代之后,按照4×104密度接种于96孔板中,在含10%fbs的dmem培养基中培养,24h细胞贴壁后更换为无血清培养基进行饥饿24h,随后,更换成含有10-6mol/l胰岛素的培养基进行造模12h,24h和48h,并且设置不加胰岛素的dmem培养基作为正常对照组。在每个时间点,检测hepg2细胞的细胞活性以及细胞葡萄糖吸收情况,以不影响细胞活性且显著降低葡萄糖吸收为细胞胰岛素抵抗模型建立的终点。(2)细胞增殖率测定当hepg2细胞传至第三代之后,按照4×104密度接种于96孔板中,在含10%fbs的dmem培养基中培养,24h细胞贴壁后更换为无血清培养基进行饥饿,继续培养24h后加入1,10,100,1000nm的蛋白,另设一对照组(细胞培养液中不加任何药物,仅加入dmem培养基),每个浓度设6个平行,继续培养24h后,每孔加入20μlcck-8溶液,置于培养箱中培养1h,再利用酶标仪测定样品在波长450nm下的吸光度。(3)葡萄糖吸收测定利用2-脱氧葡萄糖荧光类似物(2-nbdg)来测定hepg2细胞中的葡萄糖摄入量。hepg2细胞按照4×104密度接种于96孔板中,在含10%fbs的dmem培养基中培养,24h后细胞贴壁后更换为无血清培养基进行饥饿,继续培养24h后加入10-6mol/l胰岛素进行造模24h,随后换上含有0,1,10,100,1000nm蛋白的培养基,另设一对照组(细胞培养液中不加任何药物,加入dmem培养基),每个浓度设6个平行,继续培养24h后,进行葡萄糖吸收的测定。测定时,将培养基倒掉,更换为含有100nm胰岛素的培养基,胰岛素刺激10-20min,随后用干净的pbs清洗细胞两次。接着向96孔板中加入含有100μm的2-nbdg的pbs,在培养箱中培养30min,此过程需要避光,完成后,再用pbs进行清洗,在激发波长488nm,发射波长526nm条件下,测定样品的荧光值。(4)fgf21发挥活性的信号通路研究为了探究fgf21蛋白缓解胰岛素抵抗的机制,加入fgf21蛋白1000nm孵育hepg2细胞30min,1h,1.5h,6h,8h,16h,24h以及30h,提出蛋白进行westernblot。具体操作方法如下:细胞处理:以2×104/cm2的密度将细胞接种于6孔板中,培养24h,随后,换无血清培养基饥饿24h,再加入浓度为1000nm的fgf21样品,培养不同时间后取出。细胞总蛋白提取:用预冷的pbs溶液冲洗细胞三遍后,每孔加入100μl提前预冷的western细胞裂解液,轻轻混匀,使裂解液浸润到全部细胞,静置5min。随后,用细胞刮刀将细胞刮下,移液枪吹匀后转移至预冷离心管中,超声破碎后,用12000rpm离心10min,吸取上清。利用微量bca蛋白测定试剂盒测定所提取的蛋白浓度:在10ml离心管中按说明配制bca工作液,室温保存。将2mg/ml牛血清白蛋白的蛋白标准品原液稀释成不同浓度的蛋白标准品系列,稀释液与待测蛋白配制所用溶液一致。蛋白标准品梯度浓度溶液的配制见表2-4。将a-i号蛋白标准溶液及待测样品加入96孔酶标板中,每孔10μl,每个样品三次平行。随后,在酶标板每孔中加入200μl工作液,微量振荡器上震荡混匀1min,随后在37℃条件下孵育30min,再测定波长570nm下的吸光值。根据结果做出蛋白浓度-吸光度值标准曲线,计算未知细胞蛋白样品的浓度。表4:不同浓度蛋白标准品的配制sds-page电泳:配制厚度为1cm的10%分离胶以及4%浓缩胶。电泳上样时将上样量控制为5-30μg/孔。随后,先在80v的恒压条件下跑电泳约15min,待溴酚蓝跑至分离胶界面时,将电压升高至120v,直至溴酚蓝到达分离胶的底部。转膜:切胶后,利用转移缓冲液平衡胶条30min。此时,先用甲醇浸泡pvdf膜15s,进行活化,活化后用超纯水浸润2min。随后,将其与剪好的滤纸,转移组件一起放入转移缓冲液中平衡10min。接着,将样品和pvdf膜等放好,待夹子夹好后,整体放入转移槽中,在冰水浴中转膜2h(保持恒流200ma)。抗体孵育:将转印上蛋白的pvdf膜进行丽春红染色,确定蛋白完整转移后,用水洗掉可逆结合的染料。将膜封闭2h后,加入一抗稀释液孵育2h。孵育完成后,利用pbst清洗干净。随后,利用二抗稀释液再孵育1h,孵育完成后pbst清洗干净。成像:将等体积的a、b液混合,反应1min后加到膜上,待发光稳定后,用透明塑料膜包好,放入凝胶成像仪,根据自动曝光图像条带亮度调整曝光时间,选择最清晰的图像保存。9、数据统计实验结果以平均数±标准差的形式呈现,并利用spss17.0软件(spssinc.,chicago,il)进行统计分析。比较两组数据的显著性差异时,选用t检验;多组数据间比较时,选用单因素方差分析(onewayanova)。最终,以p<0.05作为显著性差异的标准。10、实验结果与分析(1)蛋白的表达由于fgf21的1-28号氨基酸为信号肽,因此从第29位氨基酸开始进行基因克隆,并且为了保留fgf21保守性的二级结构,保证其能够形成原有的空间结构,在基因克隆时选择避开了能形成α-螺旋和β-折叠的蛋白片段,最终确定对29-138,29-146以及29-209三个片段进行克隆。将fgf21的三个蛋白片段基因克隆后,利用电泳检测可知,三个片段的目的基因均克隆成功(图1)。对于构建的载体均进行基因测序,在保证没有包括移码突变在内的任何突变后,方才进行蛋白的表达。表5中的测序结果表明所构建的6个质粒均构建成功。将所构建的6个质粒转入到大肠杆菌表达菌株bl21(de3)进行表达,结果表明无论是带有his标签还是带有gst标签,在选取的三个目的蛋白片段29-138,29-146以及29-209中,均只有29-209蛋白片段可以在大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中进行大量表达(图2)。在经过iptg诱导表达目标蛋白后,鉴定得到目标蛋白存在于菌体破碎离心后得到的上清液中,表明目的蛋白的表达是可溶的,未形成难溶的包涵体。表5:载体构建和蛋白表达情况蛋白片段标签质粒测序鉴定结果目的蛋白表达情况29-138his标签pet-28a序列正确表达量低29-146his标签pet-28a序列正确表达量低29-209his标签pet-28a序列正确大量表达29-138gst标签pgex-4t-2序列正确表达量低29-146gst标签pgex-4t-2序列正确表达量低29-209gst标签pgex-4t-2序列正确大量表达(2)蛋白的纯化(a)亲和层析纯化由于只有蛋白片段为29-209的fgf21蛋白可以在大肠杆菌中大量表达,因此后期蛋白纯化均是在此基础上进行。带有his标签的蛋白可以特异性与ni柱进行结合,从而和杂蛋白分离。由亲和层析洗脱后的电泳图3a可以看出,蛋白经过ni亲和柱初步纯化后,用咪唑浓度递增的缓冲液进行梯度洗脱,fgf21蛋白在100mm和400mm咪唑下均能被洗脱,但100mm咪唑洗脱的洗脱液中蛋白含量更多。类似地,对于带有gst标签的蛋白,由电泳图3b可以看出,按照gst标签蛋白纯化标准步骤,目的蛋白能够被10mmgsh洗脱下来。蛋白纯化过程中缓冲液体系的选择会直接影响蛋白亲和纯化过程中的稳定性。fgf21蛋白的等电点为5.01,因此最初选用的缓冲液为20mmtris,500mmnacl,ph8.0。在后期实验种发现,用超滤管浓缩fgf21蛋白除去咪唑的过程中极易发生沉淀现象,这可能是由于原核表达时蛋白与大肠杆菌中核酸发生非特异性结合所致,该过程易引起多聚和沉淀。因此将溶液中的盐浓度优化为1mnacl,同时在溶液中添加dtt和β-me等抗氧化剂,在后续tev酶切去标签前的咪唑浓度稀释时,均用此缓冲液来改善沉淀现象。对于带有his标签的蛋白,收集利用100mm咪唑洗脱液洗脱得到的蛋白,进行tev酶切去除his标签后,再次加载到ni亲和柱上以除去tev酶、部分杂蛋白以及未切除his标签的目的蛋白。由图4中结果可知,已切除标签的目的蛋白主要在含有20mm咪唑的洗脱液中。切除标签后蛋白在sds-page胶上的迁移速度明显快于未切标签前,说明得到的蛋白已经切除his标签。对于tev酶切gst标签后的蛋白也收集洗脱液进行sds-page检测。图5电泳结果表明,fgf21蛋白主要存在于含有20mm咪唑的洗脱液中,且此时的杂蛋白少。切除标签后fgf21蛋白在sds-page胶上的迁移速度明显快于未切标签前,并且蛋白分子量降低,与fgf21目的蛋白分子量达到一致,说明得到的蛋白已经除掉gst标签。gst标签在400mm咪唑时被洗脱下来。(b)离子交换层析纯化对于带有his标签的蛋白,由于ni柱反挂后得到的目的蛋白洗脱液中包含1mnacl,不能直接使用离子交换,因此收集蛋白用超滤管浓缩,尽量除去盐离子后,再加载到手动装填的阴离子交换柱上,用盐离子浓度递增的缓冲液进行梯度洗脱。洗脱液进行sds-page检测的结果显示,目的蛋白主要在100mm和200mmnacl洗脱液中洗脱下来,而杂蛋白则在盐浓度为300mm以及400mm时被洗脱,分离效果较好(图6)。类似地,也将gst标签切除后的蛋白进行进一步阴离子交换层析。将洗脱液收集后通过浓缩管浓缩至1ml后,用无盐缓冲液(20mmtris-hcl,ph8.0)进行稀释,至nacl的终浓度低于50mm,再将稀释后的蛋白样品进一步加入阴离子交换柱进行纯化。洗脱后的电泳结果显示,目的蛋白主要在100mmnacl洗脱液中洗脱下来,而杂蛋白则在更高盐浓度时被洗脱(图7)。因此,fgf21蛋白与介质的结合作用弱于杂蛋白,在较低的盐离子浓度下便能够洗脱分离。(c)凝胶过滤层析纯化对于his标签的蛋白,收集阴离子交换层析柱纯化后含100mm和200mmnacl的洗脱液,用于分子筛凝胶层析进一步纯化,发现fgf21蛋白在18ml左右被洗脱出来,并且是呈均一的蛋白单峰(图8),将所收集出峰体积内的12-22ml蛋白利用sds-page检测,发现目的蛋白的纯度已达到95%以上,纯化效果好。同理,对于带有gst标签的蛋白,收集100mmnacl洗脱液,用于分子筛凝胶层析进一步纯化,发现fgf21蛋白在17ml左右被洗脱出来,且蛋白峰均一(图9)。利用sds-page检测所收集的13-23ml的蛋白,发现目的蛋白的纯度已达到95%以上,可以进行后续实验。(3)蛋白的鉴定将纯化得到的fgf21蛋白都进行质谱鉴定,表6中所列为质谱结果鉴定中评分最高的三个蛋白。根据所鉴定蛋白的分子量、unique肽段以及总pep评分可知,制备所得蛋白为fgf21蛋白,且杂蛋白少。半胱天冬酶家族蛋白常作为调节细胞凋亡的因子,而磷酸丙糖异构酶是糖酵解途径中的关键酶,这两种蛋白的表达可能与大肠杆菌表达系统的内源性调节相关。至此,从sds-page电泳以及质谱鉴定两种手段检测结果可知,经过亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析多种方法纯化后可以得到纯度在95%以上的fgf21蛋白。表6:fgf21质谱鉴定结果分子量蛋白名称accesion数据库编号unique肽段总pep评分22.3kdafgf21q9nsa137152.0327.66kda半胱天冬酶b2cis9431.7930.77kda磷酸丙糖异构酶p60174213.62(4)蛋白的产量在蛋白产量方面,该方法能够高水平地表达fgf21蛋白。利用his标签得到的fgf21的产量为每升菌液可以纯化得到1.49mg蛋白,而利用gst标签得到的fgf21蛋白为1.026mg蛋白。融合标签的引入有利于增加蛋白的表达量,融合蛋白比天然蛋白的稳定性强,标签的融合对蛋白有保护作用,可以一定程度防止水解酶降解蛋白。(5)fgf21缓解胰岛素抵抗的活性验证调节机体的糖代谢,是fgf21最主要的生理功能之一,本实施例建立起胰岛素抵抗的hepg2细胞模型,模拟了糖尿病情况下的细胞糖代谢状态,从而验证纯化所得的fgf21蛋白是否具有生理活性。hepg2细胞来源于人肝癌细胞,是一种表型和肝细胞极为相似的肝胚胎癌细胞株,没有正常肝细胞凋零衰亡的现象,并且其表面表达的高亲和力胰岛素受体能够满足胰岛素受体所要求的标准,因此被广泛应用于胰岛素抵抗模型的建立。利用胰岛素作用于hepg2造模后,由图10中cck-8细胞活性的测定结果可以看出,10-6mol/l胰岛素对于hepg2细胞活性没有显著影响。与此同时,葡萄糖吸收的结果显示,在12h时吸收情况和正常组没有显著差异,而在24h和48h均有显著下降(p<0.05),可以使得葡萄糖吸收降低27%。因此,以胰岛素浓度为10-6mol/l处理hepg2细胞24h时,细胞对葡萄糖的摄取和利用产生障碍,该浓度和时间适合于建立胰岛素抵抗模型。胰岛素抵抗模型建立之后,用1nm,10nm,100nm以及1000nm的fgf21进行了缓解胰岛素抵抗的活性验证。带有his标签和gst标签经过酶切后的蛋白在发挥胰岛素抵抗活性方面没有差别,因此,在此活性验证中仅描述his标签纯化下所得fgf21蛋白的结果。葡萄糖吸收检测方法常用的包括直接检测培养基前后细胞培养液中葡萄糖浓度差异、氚标记2-脱氧葡萄糖检测法等。若是直接检测培养前后葡萄糖浓度差异,虽简单易行但精确性较差,而使用氚标记的葡萄糖虽敏感性高但费用昂贵且有辐射损伤。目前,2-nbdg逐渐被广泛应用于检测细胞葡萄糖吸收。已有研究表明2-nbdg在hepg2细胞上具有快速摄取、在细胞内聚集、激发荧光的作用,且在一定剂量范围内与荧光强度成正比。因此,当2-nbdg被hepg2快速摄入,可以通过荧光强度的方式来量化2-nbdg的摄入量,作为hepg2葡萄糖摄入能力的衡量标准,在此章中便选择该方法进行葡萄糖吸收的检测。由图11的结果可以看出,在此四个剂量作用于hepg2细胞24小时后,对细胞活性没有影响,从而可以继续后续的实验。fgf21从1nm到1000nm均促进了hepg2细胞对葡萄糖的吸收,与模型组相比,10nm到1000nm三组的差异显著(p<0.05),且呈剂量效应。当fgf21剂量为1000nm时,葡萄糖的吸收量增加最多,造模组的葡萄糖吸收从73%恢复到90%,此时葡萄糖吸收量与正常组相比没有统计学差异。该实验证明纯化得到的fgf21具有缓解胰岛素抵抗的生物学活性。接下来,对fgf21缓解胰岛素抵抗的通路进行了验证,从图12可以看出造模组和正常组的glut1表达量低,fgf21孵育hepg2细胞从8h到32h,随着时间的增加glut1表达增强,且在16h,24h和32h时表达显著增强(p<0.05)。利用westernblot检测p-erk1/2表达水平的结果显示,与正常组相比,造模组的表达量有显著下降,加入fgf21可以增强该蛋白的表达量,其中30min和1h时,作用最为明显。实施例2fgf21蛋白结晶条件的初步优化1、主要仪器及设备本实施例使用的主要设备见表7。表7:实验仪器与设备设备名称型号生产厂家全自动结晶工作站gryphon-lcpbioray公司晶体观察显微镜crysscoreartrobbinsinstruments公司晶体培养箱国产国产涡旋混合器ms2德国ika公司台式低温离心机centrifuge5418reppendorf中国有限公司电子分析天平ar1140梅特勒托利多仪器(上海)有限公司超低温冰箱(-80℃)dw-hl668中科美菱低温科技股份有限公司ph计delta320梅特勒-托利多仪器(上海)公司分光光度计uv-2800优尼柯仪器有限公司24孔悬滴板br-pc1041bioray公司48孔晶体板hr3-180hampton公司96深孔晶体板gsk09602bioray公司2、主要试剂本实施例所使用主要实验试剂如表8所示。表8:fgf21结晶实验主要实验试剂试剂名称试剂厂家crystalscreenkits试剂盒hampton公司detergentscreenhampton公司additivescreenhampton公司100%tascimateph7.0hampton公司pegrx试剂盒hampton公司peg/ion试剂盒hampton公司saltrx试剂盒hampton公司index试剂盒hampton公司wizardclassictubessuiterigaku公司甘油sigma公司bis-trispropanesigma公司2-丙醇sigma公司hepessodiumsigma公司natrix试剂盒hampton公司structurescreen试剂盒md公司3dstructurescreen试剂盒md公司pactscreenbox试剂盒md公司jcsgplus试剂盒md公司fgf19蛋白(人源,纯度95%)r&dsystemsfgf23蛋白(人源,纯度95%)r&dsystems三羟甲基氨基甲烷(trisbase)sigma公司3、fgf21同亚家族蛋白缓解胰岛素抵抗的研究为了探究同属一个亚家族的fgf19和fgf23是否也具有缓解胰岛素抵抗的功能,选用与fgf21相同的蛋白浓度梯度进行了葡萄糖吸收测定。具体测定方式见实施例1。4、fgf21与其同亚家族蛋白结构对比从ncbi数据库中下载fgf21,fgf19和fgf23的一级序列,并利用t-coffee软件进行一级序列的对比,而蛋白二级结构的对比是在psipred蛋白序列分析软件中进行。5、fgf21蛋白质结晶条件的初筛蛋白晶体的初步筛选采用的是微量坐滴汽相扩散法,所使用的晶体生长筛选试剂盒包括crystalscreenkits、wizard、indexkit、peg/ionscreen、peg/rxscreen、saltrx、structurescreen1/2、3dstructurescreen、pactscreenbox1、jcsgplus、natrix1/2等。具体操作是:在96深孔晶体生长板的底部储液池中加入40μl的晶体筛选试剂溶液,再将1μl的fgf21蛋白(纯度足够高且浓度达10mg/ml)与1μl底部池液混合点在坐滴孔内,用透明胶带密封好后,将晶体生长板置于4℃和18℃等待晶体生长,期间尽量避免震动和温度波动,每隔3天观察一次蛋白质晶体生长情况,并做好记录。6、fgf21蛋白质结晶条件的优化晶体优化是采用24孔悬滴板和48孔晶体板进行优化,所采取的方法包括加入去污剂、加入金属离子或小分子、沉淀剂浓度优化、ph值优化以及池液缓冲液种类优化五种。对于加入去污剂、金属离子或小分子,是在48孔晶体生长板的底部储液池中加入100μl的晶体筛选试剂溶液,再将0.8μl的fgf21蛋白(纯度足够高且浓度达10mg/ml)以及0.2μl的去污剂(金属离子或小分子)与1μl底部池液混合点在坐滴孔内,用透明胶带密封好。对于沉淀剂浓度优化、ph值优化以及池液缓冲液种类优化,是利用24孔悬滴板进行,在底部储液池中加入200μl池液后,在载玻片上将fgf21和底部池液混合,加入量为蛋白1μl加池液1μl以及蛋白2μl加池液1μl,再将盖玻片用硅胶倒置于池液上,以提供密闭的环境。根据不同的优化方式进行处理后,将晶体生长板置于4℃和18℃等待晶体生长,期间尽量避免震动和温度波动,每隔3天观察一次蛋白质晶体生长情况,并做好记录。7、实验结果与分析(1)fgf21同亚家族蛋白对于胰岛素抵抗的效果通过测定fgf19和fgf23对于hepg2细胞活性和葡萄糖吸收的影响,来判定其与fgf21功能上的差别。由图13中cck-8的结果可以看出,fgf19和fgf23作用hepg2细胞24h对细胞的活性也没有显著影响。但从葡萄糖吸收的结果来看,fgf19和fgf23并不能增加葡萄糖的吸收,实验组和造模组没有显著性区别,未能起到对胰岛素抵抗的缓解作用。(2)fgf21,fgf19,fgf23结构差异分析fgf家族蛋白的结构在中间核心区域具有很强的保守型,并且同属自分泌型蛋白的fgf21,fgf19和fgf23发挥生理功能并不需要硫酸肝素的参与,而是通过与fgfr和βklotho形成复合物来发挥作用。为了探究fgf21,fgf19以及fgf23产生功能差别的原因,发明人从结构的角度进行了初步分析。从一级序列的对比发现(图14),三个蛋白在的一级结构差异大,同源性仅有35%,但在中间60-150氨基酸部分的相似程度高,这与fgf家族蛋白在核心区域保守性有关。由此二级结构对比图15可以看出,总体来说三个蛋白的二级结构相似性强,在40-160氨基酸间主要以β-strand为主,这与fgf家族蛋白中间核心区域的三叶草结构相一致,也与一级结构对比的同源性一致,说明在此部分氨基酸折叠形成了fgf家族蛋白特有的空间结构。主要的区别在于,fgf21蛋白n-端的α-helix生成得较fgf19和fgf23更晚,在第10位氨基酸之后才开始形成,且fgf21的信号肽为1-28位氨基酸,而fgf19与fgf23的信号肽均为1-24位氨基酸。而在蛋白的c-端,均是无规则的卷曲,此结构易形成较大区别。无规则的loop结构不同于α-helix或β-strand等规则结构,其与蛋白识别细胞膜表明受体相关,对于fgf21结合共配体发挥生理功能有着至关重要的作用。(3)蛋白质结晶浓度及缓冲液确定为了从空间结构的角度比较fgf21,fgf19及fgf23的差别,阐明其发挥不同功能的原因,选用蛋白质结晶的方式来解析fgf21的空间结构。fgf19的结晶条件为100mmtris-hcl(ph8.5),200mmsodiumacetate,15%(v/v)polyethyleneglycol4000,fgf23的结晶条件为100mmtris-hcl(ph8.5),1.0m(nh4)2so4,10mm[co(nh3)6]cl3。利用这两个结晶条件对于fgf21蛋白进行处理,发现并没有晶体生长。为了研究蛋白浓度、缓冲液条件和培养温度对于蛋白稳定性的影响,以得到fgf21晶体生长的条件,选用了表9中24个条件进行蛋白稳定性的测定。在标签的选择上,由于不同的标签对于蛋白在表达过程中的折叠和排列会有影响,因此his标签和gst标签所得的蛋白均进行了蛋白稳定性测定以及后续的晶体条件筛选优化。由于在蛋白质结晶的过程中,蛋白质的浓度高有利于其晶型的堆积,因此选择了10mg/ml,15mg/ml以及20mg/ml三个高浓度的蛋白溶液进行测定。在放置24小时后,蛋白浓度为20mg/ml的溶液会有细小的颗粒状蛋白沉淀产生,但在蛋白质结晶的过程中,可能存在沉淀在培养过程中逐步消失再生长为晶体的情况,因此,发明人连续观察7天来判断合适的蛋白质浓度。缓冲液和培养温度对于蛋白晶体的生长也有较大影响。其晶核的形成和晶体的不断生长都依赖于介质条件的各个条件,基于fgf21蛋白的稳定性,选用tris和hepes作为缓冲液,ph选择8.0和7.5以远离蛋白的等电点,而培养温度在18℃和4℃下进行保存。将此24个条件的蛋白进行晶体生长培养7天后,发现蛋白20mg/ml的溶液中仍有明显的沉淀产生,表明该浓度下蛋白性质不稳定。标签类型、培养温度以及ph值对于蛋白溶液的生长在肉眼下无明显影响。表9:蛋白质浓度及缓冲液选择(4)蛋白质结晶条件初步筛选结果除去20mg/ml蛋白所对应的条件外,将上述其余16种筛选条件的蛋白采用微量坐滴气相扩散法筛选以下试剂盒:crystalscreenkits、wizard、indexkit、peg/ionscreen、peg/rxscreen、saltrx、structurescreen1/2、3dstructurescreen、pactscreenbox1、jcsgplus、natrix1/2、sgc试剂盒以及md试剂盒,一共1248个初筛条件。蛋白质晶体生长是一个缓慢的过程,fgf21蛋白需要培养一个多月的时间,才能够得到较为稳定的蛋白质晶体,并且随着时间变化晶体会出现不同情况。在晶体培养3天,6天,9天时在显微镜下进行观察,均未有蛋白质晶体产生。并且,在有的条件下,混合液中出现了气泡样物体或者暗影(图16),由此可见在这些条件下不适合目的蛋白的结晶,但也可能是因为密封时不够严密,导致漏气使得晶体不生长,因此该实验重复2次以确证排除不合适的结晶条件。蛋白在晶体培养12天后,利用显微镜可以观察到有晶状物析出。这些条件中有的出现针状晶体、密集的细小晶体,有的出现形状不规则的晶体,也有的出现放射性晶体(图17所示),因此这些晶体条件需要进一步观察。在晶体培养一个月后,最初长晶体的四个条件中,有两个条件下的晶体消失了,表明目的蛋白在这两个条件下晶体性质不稳定,长时间易分解;放射性状态的晶体没有继续生长,保持不变;只有针状晶体的形态有了进一步的生长。该晶体的生长条件为saltrx的96号条件。因此,在初步筛选中,最终确定的较为稳定的蛋白质结晶条件为saltrx试剂盒中的96号,其具体条件为60%v/vtacsimateph7.0,0.1mbis-trispropaneph7.0;生长晶体的蛋白为his标签浓度为15mg/ml的蛋白,缓冲液为tris(ph8.0),培养温度为4℃。(5)蛋白质结晶条件优化结果接下来,根据初筛中选择的蛋白结晶条件进行进一步优化筛选,包括5种晶体优化的方式。具体情况如下表10所示。表10:蛋白晶体条件优化结果将这五种优化方式的所有条件,按照所述添加方法进行晶体条件的优化筛选,并且每3天观察一次蛋白质晶体的生长状况。优化结果显示,在加入去污剂、金属离子或小分子的情况下,蛋白的晶体条件没有改善,且蛋白晶体不再生长,有大量沉淀产生。对于优化沉淀剂而言,高浓度沉淀剂条件下蛋白状态不稳定,有沉淀产生。ph值的优化对于晶体的生长没有显著的改善。因此,仅在改变池液缓冲液的情况下,晶体生长状态发生了变化,在0.1mtrisph7.0以及0.1mmopsph7.0两种情况下,晶体生长情况有了改善(图18)。最终,fgf21可以在60%v/vtacsimateph7.0,0.1mtris/mopsph7.0,4℃条件下形成形态较好的晶体在蛋白质结晶过程中加入沉淀剂以降低水的流动性,增加蛋白的有效浓度是蛋白质结晶过程中的重要过程,沉淀剂的选择和优化对于晶体形成至关重要,常见的沉淀剂包括盐以及聚合物。在已发表的结晶条件中,以聚乙二醇为沉淀剂的条件占据60%。fgf19是在沉淀剂为聚乙二醇的条件下形成晶体,fgf23是在硫酸铵的条件下结晶,然而,在对fgf21结晶条件进行初步筛选时,发现这些常见的沉淀剂均未能使fgf21形成晶体。最终筛选得到的fgf21沉淀剂为tacsimate,这是丙二酸钠、醋酸钠、柠檬酸三钠、琥珀酸、dl-苹果酸、甲酸钠以及酒石酸二钠的混合物。此沉淀剂中含有大量电解质小分子,对于蛋白质晶体形成过程中的盐离子浓度和沉淀剂浓度均进行了调控,因此fgf21结晶条件的形成与沉淀剂种类以及小分子的存在密切相关。本实施例2能得出以下至少之一的结论:(1)与fgf21同属一个亚家族的fgf19和fgf23蛋白在10nm到1000nm剂量下,对hepg2细胞活性没有显著影响,但此二者不具有缓解胰岛素抵抗的功能,其一级结构与fgf21同源性仅为35%,二级结构中间核心的区域相似性高,n-端和c-端的氨基酸残基和构象相差大。(2)经过初步筛选得到fgf21结晶条件为saltrx试剂盒中的96号,其具体条件为60%v/vtacsimateph7.0,0.1mbis-trispropaneph7.0;生长晶体的蛋白为his标签浓度为15mg/ml的蛋白,缓冲液为tris(ph8.0),培养温度为4℃。该条件下,蛋白晶体呈针状。(3)加入去污剂、小分子或是金属离子对蛋白质结晶情况没有改善,并且伴有蛋白质沉淀产生。改变沉淀剂浓度和ph值也对蛋白质晶体条件的优化没有显著效果。而改变池液缓冲液的种类,将0.1mbis-trispropane更换为0.1m的tris或者mops,可以显著提高fgf21蛋白的结晶状况。最终,fgf21可以在60%v/vtacsimateph7.0,0.1mtris/mopsph7.0,4℃条件下形成形态较好的晶体。在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>中国农业大学<120>成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶<130>pidc3182559<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>550<212>dna<213>artificial<220><223>fgf21基因29-209片段的核苷酸序列<400>1cacccgattccggattcctctcagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcg60gtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgg120gacggtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaa180gccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccaga240tggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgct300tcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgcc360agggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccact420accaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccga480tgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagcta540cgcttcctga550<210>2<211>634<212>dna<213>artificial<220><223>构建体的核苷酸序列<400>2atgggcagcagccatcatcatcatcacagcagcggcgaaacctgtattttcagggcatat60cacccgattccggattcctctcagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcg120gtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgg180gacggtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaa240gccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccaga300tggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgct360tcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgcc420agggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccact480accaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccga540tgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagcta600cgcttcctgactcgagcaccaccaccaccaccac634当前第1页1 2 3 
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